正相色譜柱與反相色譜柱的區(qū)別 色譜柱的安裝 1、首先應(yīng)確認(rèn)柱和儀器的接頭以及管路是否匹配。
為減少死體積，進(jìn)樣閥、柱子、檢測(cè)器之間的連接管路內(nèi)徑盡可能使用內(nèi)徑較小的管線，同時(shí)控制進(jìn)樣器、色譜柱和檢測(cè)器之間連接管線的長(zhǎng)度。
安裝色譜柱之前，確認(rèn)流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常。
對(duì)分析較復(fù)雜的樣品建議安裝保護(hù)柱。
? 2、為了使色譜柱與儀器系統(tǒng)達(dá)*的連接效果，應(yīng)盡量使用與色譜柱接口相匹配的螺帽和錐形接頭，如原來(lái)的接頭長(zhǎng)期匹配其他類(lèi)型的色譜柱，建議在連接新色譜柱前應(yīng)檢查匹配情況，避免造成色譜柱的損壞或因色譜柱不匹配造成的漏液。
? 3、使用PEEK 材料的通用接頭，只需用手?jǐn)Q緊不需要特定扳手，使用壓力為5000psi；使用溫度不得超過(guò)100℃。
? 流動(dòng)相平衡 1、在進(jìn)行樣品檢測(cè)前，至少使用20倍柱體積流動(dòng)相使色譜柱充分平衡。
流動(dòng)相一定要使用色譜級(jí)別的溶劑。
如使用水相的緩沖液應(yīng)當(dāng)天配制以保持新鮮避免*產(chǎn)生。
? 2、流動(dòng)相使用前需用微孔濾膜過(guò)濾,*流動(dòng)相中顆粒對(duì)色譜系統(tǒng)和色譜柱的損壞。
緩沖液與其他流動(dòng)相混合后應(yīng)重新過(guò)濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀。
不應(yīng)使用純水作為流動(dòng)相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5%的有機(jī)溶劑沖洗色譜柱，同時(shí)可以達(dá)到對(duì)緩沖鹽清洗的作用。
還可以使色譜柱更容易平衡）。
? 3、流動(dòng)相需脫氣后使用，可避免因氣泡導(dǎo)致的泵和檢測(cè)器的工作不正常。
如果測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相與色譜柱保存使用的流動(dòng)相有較大區(qū)別，應(yīng)該使用過(guò)度分布的形式進(jìn)行平衡。
避免由于流動(dòng)相的突然變化造成柱壓增加過(guò)大或流動(dòng)相緩沖鹽結(jié)晶造成對(duì)色譜柱和儀器系統(tǒng)的損壞。
正相色譜柱比反相色譜柱需要更長(zhǎng)的平衡時(shí)間。
? 樣品制備與操作 1、樣品應(yīng)當(dāng)盡可能溶解在能與流動(dòng)相相互溶的溶劑中。
除特殊指明外，如使用強(qiáng)溶劑溶解樣品柱子的分辨率將可能降低。
? 2、樣品溶液在進(jìn)樣前應(yīng)使用針頭式過(guò)濾器對(duì)樣品預(yù)先過(guò)濾。
頻繁改變流動(dòng)相組成，會(huì)加速降低柱效。
? 3、色譜柱由高壓勻漿法裝填，能承受較高壓力。
為獲得*分離效果，使用時(shí)請(qǐng)不要超過(guò)200kgf，而且避免壓力突然上升或變化，否則會(huì)造成硅膠填料的破壞，減少色譜柱的使用壽命。
除特殊要求外*操作溫度不要超過(guò)60℃。
? 保存色譜柱 1、如果流動(dòng)相含有酸或無(wú)機(jī)鹽，應(yīng)當(dāng)先用去離子水（20倍柱體積）沖洗干凈。
然后用用*或保存色譜柱。
最后用柱子的接頭密封，并放在穩(wěn)定的環(huán)境中存放。
? 2、應(yīng)避免色譜柱受到直接的機(jī)械沖擊或摔落，避免造成色譜柱性能的降低。
? 色譜柱的再生：? 用相當(dāng)于20倍柱體積的溶劑按下列順序沖洗柱子，建議按柱子的箭頭方向沖洗，盡可能不反沖。
沖洗時(shí)使用的的參考溶劑順序是水、、、。
? 發(fā)展方向 因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng)3~10cm，填料粒徑2~3m。
為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。
細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
? 但由于柱體積越來(lái)越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件。
配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100l/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。
且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。
? 填充和性能評(píng)價(jià) 色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。
在正常條件下，填料粒度>20m時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒<20m時(shí)，濕法填充較為理想。
填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters*；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。
柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。
? 必須指出，*液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問(wèn)題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。
? 無(wú)論是自己裝填的還是購(gòu)買(mǎi)的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。
柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱(chēng)因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。
一般說(shuō)來(lái)容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以?xún)?nèi)。
進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。
? 一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、填料的種類(lèi)、粒度、色譜柱的柱效、不對(duì)稱(chēng)度和柱壓降等。
? 使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。
在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。
? ① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。
溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。
? ② 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?br>? ③ 一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。
否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
? ④ 選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。
有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
? ⑤ 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。
保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。
保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
? ⑥ 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，*保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。
在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。
? 下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或）、和依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。
能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。
反相柱以水、、、（或）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。
如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。
能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在（）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200l數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。
與或的混合溶液能除去類(lèi)脂。
有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。
此外，用、和（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。
? 陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、、（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、、水依次沖洗。
? ⑦ 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)或，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。
*禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
? ⑧ 色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
? 在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。
然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿(mǎn)色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。
這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
? 柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。
采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。
? 通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。
以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。
柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀?br>新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。
? 每次工作完后，*用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用沖洗至基線平衡。
當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。
含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。
裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘。
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